微波破碎細(xì)胞機(jī)理在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用

微波破碎細(xì)胞機(jī)理在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用

徽波破碎細(xì)胞技術(shù)是塞于徽波加熱的選擇性、瞬時(shí)性和高效性。通過(guò)對(duì)生物材料進(jìn)行適宜的徽波處理而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞破碎的一種細(xì)胞破碎手段。實(shí)踐表明，該技術(shù)尤其適用于胞內(nèi)小分子產(chǎn)物的提取，在天然產(chǎn)物提取分離中其有廣闊應(yīng)用前景。

自然界豐富的生物資源為人類提供了數(shù)萬(wàn)種的天然產(chǎn)物，它們是藥物、香料、食品添加劑等精細(xì)化學(xué)品的重要來(lái)源。天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，首先需要把它從生物體內(nèi)提取出來(lái)。天然產(chǎn)物的提取，工業(yè)上仍普遍采用傳統(tǒng)的浸取操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，效率低，技術(shù)水平落后。

一方面，浸取操作在提取前沒(méi)有進(jìn)行細(xì)胞破碎，細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜帶來(lái)很大的提取阻力，提取時(shí)間長(zhǎng)；另外，浸取操作不能使胞內(nèi)水解酶迅速失活，反而由于緩慢升溫促進(jìn)了酶對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的降解，珍貴的原料資源沒(méi)有被充分利用。所以，提取時(shí)間長(zhǎng)和收率低是困擾胞內(nèi)天然產(chǎn)物提取的關(guān)鍵問(wèn)題之一。目前，人們正積極從事天然產(chǎn)物提取新技術(shù)的研究，如超臨界萃取、超聲波提取、微波強(qiáng)化萃取等。

從動(dòng)力學(xué)角度考慮，細(xì)胞壁和/或細(xì)胞膜的通透性是限制天然產(chǎn)物提取速率的關(guān)鍵因素，故細(xì)胞破碎后，將大大加速天然產(chǎn)物的提取?，F(xiàn)有高速珠磨和高壓勻漿等細(xì)胞破碎方法可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物的快速釋放，但在釋放目標(biāo)產(chǎn)物的同時(shí)，胞內(nèi)水解酶一起被釋放出來(lái)。釋放后的水解酶和目標(biāo)產(chǎn)物相遇，造成目標(biāo)產(chǎn)物的損失。而且提取液中含有大量蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，加重了后續(xù)分離純化的負(fù)擔(dān)。故上述細(xì)胞破碎方法都不適合天然產(chǎn)物的提取。因此，研究專門(mén)適合生物小分子提取的細(xì)胞破碎方法，對(duì)于天然產(chǎn)物的研究開(kāi)發(fā)具有重要意義。我們針對(duì)天然產(chǎn)物一般熱穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，將微波技術(shù)用于細(xì)胞破碎，建立了一種適合生物胞內(nèi)小分子提取的細(xì)胞破碎技術(shù)—微波破碎細(xì)胞。

微波破碎細(xì)胞是基于微波加熱的選擇性、瞬時(shí)性和高效性，控制適宜的微波條件而實(shí)現(xiàn)的。微波破碎后的細(xì)胞，由于減小了提取阻力，其胞內(nèi)小分子物質(zhì)的溶出變得非常容易，可大大縮短提取時(shí)間。此外，微波處理還能使胞內(nèi)目標(biāo)產(chǎn)物的水解酶失活，避免提取過(guò)程中目標(biāo)產(chǎn)物的降解。因此，我們提出了“微波破細(xì)胞提取”的概念，并成功地進(jìn)行了酵母胞內(nèi)海藻糖及藥用植物高山紅景天愈傷組織中紅景天成的提取。本文首先以酵母細(xì)胞為例闡明微波破碎細(xì)胞的機(jī)理，然后，通過(guò)實(shí)例對(duì)比說(shuō)明微波破細(xì)胞提取技術(shù)的優(yōu)越性。

微波是一種頻率由30 00MHz至30 00GHz的高頻電磁波，它具有電磁波的諸如反射、透射和干涉、衍射、偏振、以及伴隨著電磁波的能量傳輸?shù)炔▌?dòng)特性，而且可用于加熱.微波是通過(guò)使微波場(chǎng)中的極性分子或偶極子的快速擺動(dòng)產(chǎn)生類似摩擦的作用而獲得能量，給介質(zhì)加熱的。微波加熱具有很好的選擇性，不同物料由于其介電性質(zhì)不同，在微波場(chǎng)中的受熱特性有很大的差別。水及陰陽(yáng)離子等能被微波迅速加熱，而玻璃、聚四氟乙烯等則是對(duì)微波透明的，不吸收微波能，從而不能被微波加熱。此外，微波加熱高效快速，易于實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、自動(dòng)化。鑒于微波技術(shù)的上述特點(diǎn)，微波在食品干燥、滅菌、膨化等領(lǐng)域已獲得廣泛的工業(yè)應(yīng)用。

醉母菌具有典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，由細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞核、液泡、線粒體和細(xì)胞質(zhì)等構(gòu)成。酵母細(xì)胞的原生質(zhì)中含有一個(gè)或多個(gè)大小不等的液泡，液泡直徑為。..-u33m.在靜止生長(zhǎng)期的細(xì)胞中特別明顯，常為最大的細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中開(kāi)始出芽時(shí)，大的液泡被擠壓分成兩個(gè)小的液泡，芽形成時(shí)，液泡被分配到母細(xì)胞和子細(xì)胞中。出芽完畢后，小的液泡重新結(jié)合或融合而形成大的液泡。由微波加熱原理可知，正、負(fù)離子和水等極性物質(zhì)對(duì)微波的吸收能力比較強(qiáng)，而非極性物質(zhì)幾乎不吸收微波。由于酵母細(xì)胞具有典型的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞不同部位或不同細(xì)胞器中，正、負(fù)離子和水等極性物質(zhì)的分布是不均勻的，因此，當(dāng)把酵母細(xì)胞置于微波場(chǎng)中處理時(shí)，酵母細(xì)胞將會(huì)局部受熱。

酵母細(xì)胞在微波場(chǎng)中局部受熱是酵母細(xì)胞微波破碎的物理夔礎(chǔ)。液泡是酵母細(xì)胞內(nèi)部富含自由水的部位，當(dāng)酵母細(xì)胞接受微波輻射時(shí)，自由水大量吸收微波能，迅速受熱，溫度達(dá)到沸點(diǎn)而汽化，使得胞內(nèi)壓力升高。酵母細(xì)胞壁和細(xì)胞膜所能承受的內(nèi)壓有限，當(dāng)微波加熱引起的胞內(nèi)壓力上升到細(xì)胞所能承受的極限時(shí)，酵母細(xì)胞將被脹破，細(xì)胞發(fā)生破碎。

通過(guò)對(duì)微波破碎前后的酵母進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞微波破碎一般首先發(fā)生在細(xì)胞出芽部位。筆者對(duì)此現(xiàn)象解釋如下：對(duì)于帶芽的細(xì)胞，母細(xì)胞和子細(xì)胞分別含有自己的液泡，因此，當(dāng)酵母在微波場(chǎng)中接受處理時(shí)，其母體和芽均受熱產(chǎn)生內(nèi)壓，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生兩個(gè)反向的拉力。使得芽脫離母體，細(xì)胞在其出芽部位破裂：對(duì)于處于G，期的細(xì)胞，胞內(nèi)各方向內(nèi)壓相等，但芽痕處為細(xì)胞壁的一體性遭受過(guò)破壞的部位，更容易導(dǎo)致應(yīng)力集中，故細(xì)胞在芽痕處破開(kāi)。

酵母細(xì)胞在微波場(chǎng)的作用下，首先在出芽部位破裂，這時(shí)，若繼續(xù)對(duì)其進(jìn)行微波輻射，細(xì)胞將受熱脫水，迅速被干燥。相應(yīng)地，在細(xì)胞壁的其它部位，出現(xiàn)龜裂。綜上所述，微波破碎細(xì)胞是兩種機(jī)制先后作用的結(jié)果。首先是細(xì)胞的局部受熱導(dǎo)致內(nèi)壓升高，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜首先在其最脆弱部位破裂;然后。細(xì)胞脫水干燥，表面出現(xiàn)龜裂。從經(jīng)不同微波處理時(shí)間的酵母細(xì)胞的掃描電鏡照片可清楚地觀察到酵母細(xì)胞微波破碎的這兩個(gè)不同階段。

處于出芽階段的酵母（B）不帶芽的醉母圖1，酵母細(xì)胞微波破碎機(jī)理示愈圖3。嫩波破碎細(xì)胞技術(shù)在天然產(chǎn)物提取中的應(yīng)用海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子結(jié)合而成的非還原性雙搪。廣泛存在于隱生生命的生物即脫水的動(dòng)植物體內(nèi)，井賦予這類生物抵御高溫、干早、脫水等不良環(huán)境脅迫的能力。此外，海藻搪具有在干燥條件下保持蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能不受破壞的特異功效。因此，作為一種生物制品活性保護(hù)劑和食品添加劑，海藻糖在蛋白質(zhì)、酶類、疫苗、菌苗、基因工程藥物以及食品、化妝品的生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。釀酒酵母，特別是面包酵母胞內(nèi)海藻糖含量豐畜，為市售海藻糖產(chǎn)品的重要來(lái)源。由于海藻糖水解酶一海藻塘酶與海藻搪共存于醉母細(xì)胞中。因此，為防止海藻精的降解，醉母胞內(nèi)海藻糖的提取，大多以高濃度酒精為溶劑，在沸點(diǎn)下進(jìn)行。而采用微波破細(xì)胞提取技術(shù)，以水為溶劑，在室溫下只需10分鐘就能完成提取操作，且海藻糖收率比傳統(tǒng)提取高加%。另外，與傳統(tǒng)工藝相比較，微波破細(xì)胞提取，蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)溶出較少，從而減小了目標(biāo)產(chǎn)物后續(xù)分離的負(fù)擔(dān)。

制品活性保護(hù)劑和食品添加劑，海藻糖在蛋白質(zhì)、酶類、疫苗、菌苗、基因工程藥物以及食品、化妝品的生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。釀酒酵母，特別是面包酵母胞內(nèi)海藻糖含量豐畜，為市售海藻糖產(chǎn)品的重要來(lái)源。由于海藻糖水解酶一海藻塘酶與海藻搪共存于醉母細(xì)胞中。因此，為防止海藻精的降解，醉母胞內(nèi)海藻糖的提取，大多以高濃度酒精為溶劑，在沸點(diǎn)下進(jìn)行。而采用微波破細(xì)胞提取技術(shù)，以水為溶劑，在室溫下只需10分鐘就能完成提取操作，且海藻糖收率比傳統(tǒng)提取高加%。另外，與傳統(tǒng)工藝相比較，微波破細(xì)胞提取，蛋白質(zhì)等大分子雜質(zhì)溶出較少，從而減小了目標(biāo)產(chǎn)物后續(xù)分離的負(fù)擔(dān)。

以上事例表明，微波破碎技術(shù)不但從理論上豐富了細(xì)胞破碎的內(nèi)涵，而且具有很高的實(shí)用價(jià)值，該技術(shù)對(duì)于生物胞內(nèi)小分子的提取具有一定的普適性。與傳統(tǒng)提取方法相比，微波破細(xì)胞提取具有具有很大的優(yōu)越性，主要表現(xiàn)在提取時(shí)間短、目標(biāo)產(chǎn)物收率高、雜質(zhì)溶出少等方面。因此，微波破細(xì)胞提取是一種省時(shí)、高效、節(jié)能、清潔安全的天然產(chǎn)物提取技術(shù)。由于化學(xué)合成新藥開(kāi)發(fā)的難度增大，國(guó)外著名醫(yī)藥公司及研究機(jī)構(gòu)紛紛把眼光投向大自然，從植物中尋找新藥。我國(guó)中草藥文化博大精深。有很好的知識(shí)積累，并逐漸得到國(guó)際上的承認(rèn)。我們希望微波技術(shù)能在我國(guó)中藥現(xiàn)代化進(jìn)程中及天然藥物研究開(kāi)發(fā)等方面發(fā)揮其應(yīng)有的作用，為中藥走向世界盡一份力。